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22.10.2014 : 17:23 : +0200

Fluoreszenz

Innerhalb der letzten Jahre hat sich die Fluoreszenzspektroskopie zu einem bedeutenden Hilfsmittel in Biologie, Pharmazie und Medizin entwickelt. Eine Vielzahl von Biomolekülen kann mit ihrer Hilfe präzise beobachtet, identifiziert und verfolgt werden. Eine sehr lange bekannte Technik ist, Zellen und zelluläre Bestandteile durch Anfärben mit Farbstoffen sichtbar zu machen. Unter Zuhilfenahme der Fluoreszenz ist es heutzutage möglich, Bewegungen selbst einzelner Moleküle in lebenden Zellen zu beobachten.

Was ist Fluoreszenz und wodurch ist sie charakterisiert?

Nachdem ein Farbstoffmolekül durch Absorption eines Photons elektronisch angeregt wurde, befindet es sich in einem metastabilen Zustand. Bei den meisten Farbstoffen wird die absorbierte Photonenenergie sehr schnell in Form von Wärme an die Umgebung abgegeben. Nur in sehr wenigen Farbstoffen ist diese strahlungslose Desaktivierung langsam genug, so dass Übergänge vom angeregten Zustand in den Grundzustand an Bedeutung gewinnen, bei denen die überschüssige Energie durch Emission eines Photons (Fluoreszenz) abgegeben wird.

Ein Fluoreszenzfarbstoff ist durch seine spektroskopischen Eigenschaften wie Anregungs- und Emissionsspektrum, Fluoreszenzquantenausbeute (ηfl) und Fluoreszenzabklingzeit (τfl) charakterisiert. Die Fluoreszenz des Farbstoffs ist unabhängig von der Wellenlänge der Anregung.

Spektrale Eigenschaften

Die spektralen Eigenschaften eines Fluoreszenzfarbstoffes sind sehr stark abhängig von der Molekülstruktur. Damit die Absorption eines Moleküls im sichtbaren Wellenlängenbereich (400 - 700 nm) liegt, muss die Energiedifferenz zwischen Grund- und angeregtem Zustand hinreichend niedrig sein. Das auffälligste Strukturmerkmal eines Farbstoffs ist ein konjugiertes pi-Elektronensystem.

In den meisten Fällen ist das Fluoreszenzspektrum eines Farbstoffes in erster Näherung ein Spiegelbild der längstwelligen Absorptionsbande, wobei die Fluoreszenz typischerweise um 25 - 40 nm zu längeren Wellen verschoben ist. Dieser so genannte Stokes-Shift ist hauptsächlich auf eine Umorientierung der den Farbstoff umgebenden Lösungsmittelmoleküle zurückzuführen.

Fluoreszenzquantenausbeute (ηfl)

Eine der wichtigsten Eigenschaften eines Fluoreszenzfarbstoffes ist die Fluoreszenzquantenausbeute (ηfl). Die Quantenausbeute beschreibt das Verhältnis von emittierten Photonen (nfl) zur Zahl der absorbierten Photonen (nabs).

ηfl = nfl / nabs

Somit kann die Fluoreszenzquantenausbeute 100 % nie überschreiten.

Für die Untersuchung eines Farbstoffs mittels Fluoreszenz ist natürlich eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute von Vorteil und wünschenswert.

Fluoreszenzabklingzeit (τfl)

Die Emission eines Fluoreszenzphotons nach der Anregung ist ein statistischer Vorgang. Somit ist die Dauer, für die ein einzelnes Molekül im angeregten Zustand verbleibt, ebenfalls eine statistische Größe. Betrachtet man jedoch ein Ensemble von vielen identischen Molekülen, so ergibt sich eine wohldefinierte Zerfallsstatistik. Nach erfolgter Anregung mittels eines kurzen Laserpulses nimmt die Zahl der Moleküle im einfachsten Fall exponentiell ab. Die Zeit, nach der die Zahl der angeregten Moleküle (n1) auf den Faktor 1/e (ca. 37%) abgesunken ist, nennt man Fluoreszenzabklingzeit (τfl).

n1(t) = n1(0) exp(- t / τfl)

Die Fluoreszenzabklingzeit ist eine wichtige Eigenschaft eines Farbstoffs und kann zu seiner Identifizierung verwendet werden. Werte von τfl liegen typischerweise im Bereich von Nanosekunden.

Molekulare Wechselwirkungen

Die Fluoreszenzabklingzeit, wie auch die Fluoreszenz-Quantenausbeute eines Farbstoffes, ist keine unveränderliche Größe, sondern wird durch die Umgebung des Farbstoffes (Lösungsmittel, Temperatur) beeinflusst. Abklingzeit und Quantenausbeute des Farbstoffes sind dabei nicht unabhängig voneinander, sondern sind über folgende Beziehung miteinander verknüpft:

τfl = τ0 × ηfl

τ0 ist die sogenannte natürliche Abklingzeit, die im Fall fehlender strahlungsloser Desaktivierung (ηfl = 100%) auftreten würde.

Demzufolge können Änderungen in der Fluoreszenzabklingzeit Auskünfte über Änderungen der lokalen Umgebung des Farbstoffmoleküls liefern. Eine Vielzahl an Experimenten wurde durchgeführt, um den Effekt der Fluoreszenzlöschung (quenching) zu untersuchen. Dieses Phänomen lässt sich z.B. zum Nachweis bestimmter DNA-Sequenzen verwenden (intelligent probes, GenePin).

 

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